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微生物单菌基因组
微生物单菌基因组
        微生物广泛存在于自然界中,与人类的生产和生活息息相关,一般分为真菌、放线菌、细菌、螺旋体、立克次体、衣原体、支原体和病毒等(以下统称为单菌)。20世纪90年代后期开始了单菌基因组的研究,这项研究从单菌完整的全基因核苷酸测序入手,在分析基因结构的基础上,认识单菌的完整生物学功能。 由于单菌基因组研究具有目标明确、相对投入少、收效快、成果易于转化为产品等许多优点,目前越来越多的单菌基因组被测序并发表。
       随着测序成本的大幅度降低以及测序效率的数量级提升,全基因组测序对单菌基因组学研究起到了巨大的推动作用。通过全基因组序列,可构建该物种的基因组数据库,为后续研究该物种的生长、发育、进化、起源等重大问题搭建一个高效平台,并为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。全基因组测序可从基因组水平对单菌产生全新的认识,后续的基因组结构及功能的研究,可为微生物在医药及工农业领域中,进行创新性理论研究和应用研究提供机遇及奠定重要基础。
       根据目前单菌基因组的主要研究方向,主要包括以下三种类型:细菌基因组测序、真菌基因组测序及小基因组测序。

细菌基因组测序分析
        细菌基因组测序,可分为细菌基因组de novo测序和细菌基因组重测序两类。细菌基因组de novo测序,即从头测序是指不需要任何现有的序列信息就可以对某个细菌物种进行测序,利用生物信息学分析手段对序列进行拼装,从而获得该细菌物种的基因组序列。细菌基因组重测序是对已有参考序列(Reference Sequence)的物种的不同个体进行基因组测序,并以此为基础进行个体或群体水平的差异性分析。可关注大量的单核苷酸多态性位点(SNP)、插入缺失(InDel, Insertion/Deletion)、结构变异(Structure Variation,SV)等变异信息。细菌基因组测序可以预测重要基因和蛋白以了解其功能和可能机制,已取代传统方法成为研究细菌进化遗传机制、关键功能基因的重要工具。
       根据不同的研究目的和需求,细菌基因组测序可具体分为以下产品:

细菌重测序

       构建小片段文库,深度测序,基于已知参考基因组关注基因组变异情况(包括SNP和InDel等),可进行群体研究。

细菌denovo测序

细菌框架图:构建小片段文库,采用高深度测序(100X)和初级的基因组从头组装策略,可满足细菌基因组研究的基础需求。
细菌精细图:构建大片段和小片段文库,采用高深度测序(150X)和针对性的基因组从头组装策略,是目前细菌基因组研究的主导产品。
细菌完成图:根据待测菌株具体情况量身定制最优策略,构建不同大小片段及类型文库,综合利用多种高通量测序技术及组装技术,最终组装得到一条完整的基因组序列(1 Contig,0 gap),是细菌基因组测序从头组装的最高标准。
  • 流程图
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  • 技术参数


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  • 案例:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)全基因组测序揭示其传播机制及系统发育
    Genome sequencing defines phylogeny and spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a high transmission setting. Genome Res. 2015 January; 25(1): 111–118.

    耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种常见的引发医院内感染的致病菌,本研究对泰国东北部一家医院分离出的79株菌进行了全基因组测序,绘制了该菌的系统发育树,并发现了多个不同进化支,据此推理出感染病人之间的MRAS传播途径。


  • 技术参数

    产品 测序策略 交付指标 周期
    细菌重测序 HiSeq/MiSeq, 500bp文库 ≥100X 40个工作日
    细菌框架图 HiSeq/MiSeq, 500bp文库 ≥100X 35个工作日
    细菌精细图 HiSeq/MiSeq, 500bp+6K文库 ≥150X
    (小片段100X, 大片段50X)
    1-7M: Scaffold<25个
    7-10M: Scaffold<45个
    45个工作日
    细菌完成图 多测序平台及多类型文库 1 Contig, 0gap 75个工作日

    样品要求

    样品类型 检测方法 总量 浓度 其他要求
    DNA Qubit、AGE 小片段文库:≥ 1.5μg
    大片段文库:≥20μg
    PCR-free :≥10μg
    小片段文库: > 50ng/µL
    大片段文库: > 133 ng/µL
    PCR-free : ≥30 ng/μL
    OD260/280= 1.8~2.0


  • Q1.为什么构建PCR-free文库可以改善细菌组装效果?

    A1.PCR-free 文库主要是针对异常GC的菌株样本,在文库构建过程中不需要进行 PCR 扩增。一般的文库构建过程中需要进行PCR 扩增,但高 GC 或低 GC 的区域会在 PCR 过程中不容易扩增,导致在的测序过程中该区域覆盖度降低。PCR-free 文库可以降低这种偏差,从而提高该区域的覆盖度,进而达到改善组装的目的。

    Q2.细菌重测序是否可以提供组装?

    A2.目前我们的细菌重测序产品,可以采用基于组装和不基于组装的两种流程。 如无特殊指定,我们会默采取基于组装的流程,经过简单组装后,通过大片段与参考序列的比对来寻找变异。不基于组装的流程指的是直接将测序后生成的一致性序列与参考序列比对,进而寻找变异。

    Q3.若细菌基因组有同源性比较高的参考序列,是否可以基于重测序的方法将其组装到精细图?

    A3.我们不建议采取这种方法,因为根据参考序列组装进行,组装出来的序列就是参考序列,会导致一些突变区域无法组装出来,建议直接选用精细图组装策略。

    Q4.如果细菌中含有质粒,是否可以进行细菌基因组测序?

    A4. 1).若老师仅关注基因组信息,并且具有基因组的参考序列,我们可以通过与参考序列比对的方法将质粒序列去除。如果质粒序列中存在与基因组序列相似的序列,则去除效果可能会不佳,导致质粒序列可能会被组装到细菌基因组中。若老师想同时关注质粒序列,我们可以将质粒相关序列提取出来进行拼接,但是可能会遗漏一些质粒序列,导致质粒的信息不完整。
    2).若老师需要特别关注质粒的组装信息,我们建议老师最好是将质粒单独提取出来进行测序然后进一步组装分析。
真菌基因组测序分析
        真菌的基因组通常较大且复杂,传统的技术无法满足真菌全基因组研究的大数据量需求,新一代高通量测序技术,以其高通量、高准确率、周期快的特点,为真菌的研究提供强有力的支撑平台。真菌基因组测序,可分为真菌基因组de novo测序和真菌基因组重测序两类。真菌基因组de novo测序,即从头测序是指不需要任何现有的序列信息就可以对某个真菌物种进行测序,利用生物信息学分析手段对序列进行拼装,从而获得该真菌物种的基因组序列。真菌基因组重测序是对已有参考序列(Reference Sequence)的物种的不同个体进行基因组测序,并以此为基础进行个体或群体水平的差异性分析。可关注大量的单核苷酸多态性位点(SNP)、插入缺失(InDel, Insertion/Deletion)、结构变异(Structure Variation,SV)等变异信息。真菌基因组测序可以预测重要基因和蛋白以了解其功能和可能机制,已取代传统方法成为研究真菌进化遗传机制、关键功能基因的重要工具。
       根据不同的研究目的和需求,真菌基因组测序可具体分为以下产品:

真菌重测序

       构建小片段文库,基于已知参考基因组关注基因组变异情况(包括SNP和InDel等),可进行群体研究。

真菌denovo

真菌框架图:构建小片段文库,采用高深度测序(≥100X)和初级的基因组从头组装策略,可满足细菌基因组研究的基础需求。
真菌精细图:构建大片段和小片段文库,采用高深度测序(≥200X)和针对性的基因组从头组装策略,是目前细菌基因组研究的主导产品。
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  • 技术参数


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  • 案例:基因组联合转录组准确预测曲霉次级代谢产物基因簇
    Andersen MR, Nielsen JB, Klitgaard A, et al. Accurate prediction of secondary metabolite gene clusters in filamentous fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2013;110(1):E99-E107.

    本研究通过曲霉基因组联合转录组的测序方法,主要预测得到基因簇所在的长度;获得实验条件下不同次级代谢产物的合成情况;结合基因表达数据,进一步发现存在cross-chemistry的超级基因簇;次级代谢产物研究的方法可以推广到到其他基因组的多组学的组合研究。

    色素合成基因簇表达模式及对应色素合成基因簇中每个基因的得分


  • 技术参数

    产品 测序策略 交付指标 周期
    真菌重测序 HiSeq/MiSeq, 500bp ≥100X 40个工作日
    真菌框架图 HiSeq/MiSeq, 500bp ≥100X 35个工作日
    真菌完成图 HiSeq/MiSeq
    500bp+2K+6K
    或 500bp+2K+6K+10K
    ≥200X
    简单基因组:
    Scaffold N50 ≥500K
    复杂基因组:
    Scaffold N50 ≥300K
    75个工作日

    送样要求

    样品类型 检测方法 总量 浓度 其他要求
    DNA Qubit、AGE 500bp : ≥ 1.5μg
    2K-6K : ≥20μg
    PCR-free :≥10μg
    10K : ≥30μg
    PCR-free : ≥10μg
    小片段文库: > 50ng/µL
    大片段文库: > 133 ng/µL
    PCR-free : ≥30 ng/μL
    OD260/280= 1.8~2.0


  • Q1. 真菌基因组测序,样品要求是什么?

    A1.样品准备方面,建议选取无性生殖阶段、营养体的菌丝。如果实验条件允许,最好挑取单个孢子培养萌发大量菌丝,然后利用这些由同一孢子萌发的菌丝进行样品制备。同时为检测样品是否有细菌的污染,建议老师送样之前做一下16S检测或TA 克隆,以进一步保证整个真菌测序项目的进展。

    Q2.真菌重测序提供组装吗?

    A2:目前我们的真菌重测序产品是不基于组装进行分析的, 直接通过 reads 与参考序列比对来寻找变异。

    Q3.对于无法单独培养的寄生真菌,是否可以做基因组测序?

    A3.对于这种无法分离的混合样品,如果寄主的物种序列已知,我们可以通过参考序列比对的方式将寄主的序列过滤掉,然后再进行组装,但如果寄主的物种序列未知,这种情况无法进行序列区分,则很难得到真菌的基因组信息。

    Q4. 真菌框架图和精细图的区别是什么?

    A4.框架图和精细图最大的区别在于组装水平不一样, 框架图我们会调整组装参数, 但是没有承诺组装指标,精细图我们有相应的组装指标(scaffold N50>500kb)。另外,在做精细图之前我们会对基因组做的一个初步的整体调查(初步组装),包括基因组大小、 GC 含量高低、 重复序列的多少、 杂合度大小以及是否受到污染,以评估是否最终能做到精细图。

    Q5. 如果真菌的所有相关息都未知,是否可以通过基因组测序组装得到精细图?

    A5.对于这种完全未知的真菌,我们推荐老师先做基因组初级组装。做初级组装的目的是估测基因组大小,了解基因组中都包括哪些序列以及这些序列的特征,如GC含量,重复序列情况等;根据初级组装的结果可以初步判断该物种是否能做到高级组装指标。目前, 可以利用optical mapping, 生物信息的方法,多平台混合测序以及多种信息分析软件混合组装等方法,能够有效提高DNA组装效果。
小基因组测序分析
        随着新一代测序技术的迅猛发展,全基因组测序已经成为各类基因组研究不可或缺的重要工具。基于新一代测序技术的全基因组测序,可以拼接组装出小基因组序列同时预测重要基因,可作为大基因组或复杂基因组的辅助参考。
       小基因组测序产品,主要包括叶绿体、线粒体、病毒、质粒、BAC和Fosmid等小基因组方面的测序。
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  • 案例:猪肺炎支原体基因组学分析
    Liu W, Xiao S, Li M, et al. Comparative genomic analyses of Mycoplasma hyopneumoniae pathogenic 168 strain and its high-passaged attenuated strain. BMC Genomics. 2013;14:80.

    本研究选取两株猪肺炎支原体:一株高毒力菌株168,一株是低毒菌株168-L。进行全基因组测序分析。主要发现了一些可能与毒力相关的变异,这些变异坐落在支原体黏附素(P97,P102,P146,P159,P216,LppT)、细胞膜蛋白(P95),细胞表面抗原(P36)、分泌蛋白、伴侣蛋白(DnaK)以及与新陈代谢和内生长有关的基因;在一些毒力相关的基因上出现串联重复序列单元拷贝数变异(如E863, P146, P159, P216, LppT);总共发现了330个遗传变异,这里包含了一些已经报道和未报道的与毒力相关的基因。全基因组比较分析的方法,不仅仅可以缩小毒力基因的查找范围,还可以成为一种促进疫苗开发的手段。


  • 技术参数

    产品 测序策略 交付指标 周期
    小基因组测序 HiSeq/MiSeq, 500bp ≥100X 40个工作日

    送样要求

    样品类型 检测方法 总量 浓度 其他要求
    DNA Qubit、AGE > 1.5μg > 50ng/µL OD260/280= 1.8~2.0


  • Q1.对于病毒、噬菌体等小基因组测序,主要遇到的问题是什么?

    A1:主要问题就是病毒、噬菌体等小基因组DNA样品一般都会有大量的宿主 DNA 污染,而病毒由于变异速率快, 很少有同源性高于 80%的参考序列可以比对参考, 因此建议老师尽量在 DNA 提取过程中避免宿主 DNA 的污染,否则对后期的测序数据会有很大的影响。

    Q2.是否可以对RNA病毒进行基因组测序?

    A2.可以,但是需要老师提供反转后的cDNA样品进行后续的测序分析。

    Q3.什么是BAC文库,什么是Fosmid文库?

    A3.BAC (Bacterial Artificial Chromosome, 细菌人工染色体)文库,是全基因组图位克隆、全基因组测序、物理图谱的构建、染色体步查以及基因筛选的最好材料。也是永久保存基因资源的最好方法之一。BAC文库是现代基因组学研究的重要工具,它可以直接用于基因克隆、物理图谱的构建、全基因组测序、比较基因组学研究及分子标记的筛选、基因结构和调控等,在某种程度上说起到基因组研究―“平台”的作用。

    Fosmid文库和BAC 文库类似,只是比之小很多(Fosmid文库一般是30~40K,而BAC文库一般是100~200K),Fosmid 文库的构建要比BAC文库快得多。并且,BAC 文库的构建存在很大困难,而Fosmid 文库的技术难度要低的多。Fosmid文库在对指定区域的快速测序中扮演了重要的角色。对Fosmid大片段库进行随机测序,通过paired-reads 的信息,可以检测基因组组装的可靠性。

环境微生物
环境微生物
        微生物世界是分子多样性最大的天然资源库,基于菌株水平的传统分离培养技术为人们认识微生物多样性提供了可能,但是据估计自然界中超过99%的微生物不能通过传统的分离培养技术获得其纯培养,从而导致环境微生物中的多样性基因资源难以被发现。许多重要的微生物我们还不能识别,随着微生物活性产物的广泛研究和深入开发利用,从环境微生物中筛选到新活性物质的几率将逐步下降。而如何开拓利用环境微生物新资源是微生物研究的重要课题。为此研究者们开发了多种以特定环境微生物为研究对象的高通量测序方法。
       根据研究目的不同,环境微生物测序主要包括以下几种类型:扩增子测序;宏基因组测序;宏转录组测序
        与传统研究方法相比,环境微生物测序有其独特的优点:
1、不需要对微生物进行分离培养;
2、通量大,准确性高,更为高效;
3、鉴定物种更全面,能鉴定到丰度很低的微生物群落,在挖掘更多基因资源方面有更大的优势。

扩增子测序分析
        扩增子测序可以根据不同需求,对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行高覆盖度测序,进而分析序列中的变异情况及丰度信息,从而获得环境样品中群落多样性信息。基于扩增子的分析在微生物分类鉴定,微生态研究等方面起着重要的作用。
       根据不同的研究目的和需求,真菌基因组测序可具体分为以下产品:

16s rDNA测序

       16S rDNA 是细菌分类学研究中最常用的 “分子钟”,其序列包括9个可变区和10个保守区。采用二代高通量测序仪MiSeq对16s rDNA的某高变区测序可以获得特定环境中细菌和古菌物种组成及丰度信息。

18s rDNA/ITS测序

       118s rDNA和ITS序列分析已被广泛应用于真菌分类学鉴定。18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA(18SrRNA)的DNA序列,序列中既有保守区又有可变区,高变序列区域主要体现物种间的差异;ITS位于核糖体rDNA18S、5.8S及28S之间属于中度保守的区域,利用它可研究种及种以下水平分类。采用二代高通量测序仪MiSeq对18s rDNA可变区及ITS进行测序可以获得特定环境中真菌物种组成及丰度信息。

目标区域测序

       根据研究需求对特定目标片段,进行高通量测序,根据片段长度按需选择MiSeq或者HiSeq测序。
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  • 案例1:家庭微生物组—通过人体微生物群落研究对象和环境的互作
    Simon, Lax, Daniel, P, Smith, Jarrad, Hampton-Marcell, et al. Longitudinal analysis of microbial interaction between humans and the indoor environment. Science, 2014, 345(6200): 1048-1052

    本研究选取7个美国家庭,共1625份样本,取样部位包括人体&宠物(猫、狗)鼻腔、手、脚后跟;房屋:前门/浴室/厨房门把手、卧室/厨房地板、厨房台面、厨房灯开关等。选取16s rDNA V4区(MiSeq PE 150)并联合宏基因测序(MiSeq PE 250, HiSeq 2000)。
    主要得出如下结论:
    1,不同家庭微生物结构差异很大,且人体微生物是影响家庭微生物结构的主要因素。
    2,每一家庭有其特定的微生物指纹图谱。
    3,通过宏基因组学测序得到一具有潜在人致病性的病原菌草图,这一来自厨房台面的致病菌与人手上的致病菌是匹配的。
    4,通过对搬家家庭微生物结构的研究发现,新家微生物组成很快达到与原来家庭相似的结构,反映了家庭微生物快速的殖民能力。

    人和家庭环境之间微生物种类普遍共享


    案例2:不同来源的酿酒葡萄微生物多样性研究
    Bokulich NA, Thorngate JH, Richardson PM, Mills DA. Microbial biogeography of wine grapes is conditioned by cultivar, vintage, and climate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2014;111(1):E139-E148.

    本研究通过对不同品种、不同地区、不同年份的酿酒葡萄16s rDNA V4区及ITS1区测序,获得了每种酿酒葡萄表面细菌和真菌物种信息。并得出了如下结论:
    1, 酿酒葡萄表面的微生物群落组成及丰度与品种、地域、气候等条件密切相关;
    2, 酿酒葡萄表面的微生物组成与葡萄酒的风味密切相关。

    来自不同葡萄园的夏敦埃酒细菌(上面)和真菌(下面)的物种组成


  • 技术参数

    产品 策略 指标 周期
    16S/18S/ITS/目标区域 MiSeq PE 300 1、每个样品最低 30,000条raw tags
    2、每个样品最低 50,000条raw tags
    40个工作日
    45个工作日

    送样要求

    样品要求 检测方法 总量 浓度
    DNA或PCR产物 Qubit,AGE DNA≥300ng
    PCR产物≥400ng
    DNA≥10 ng/μl
    PCR产物≥20 ng/μl


  • Q1:16s rDNA与宏基因组测序有何不同?

    A1: 16S测序以分类研究为核心,可以提供物种分类,物种丰度以及系统进化分析。宏基因组测序除了能提供物种分类,物种丰度分析之外,还能做基因功能以及代谢通路相关的研究。

    Q2:amplicon 测序扩增引物如何推荐?

    A2:一般是将16SrDNA 测序拼接得到的tags 与专门数据库进行比对,最终的物种注释的种类比较依赖于数据库,所以如果数据库能分到种的级别我们的结果中也会有。

    Q3:GC含量异常会影响PCR效率吗?

    3:GC含量异常主要影响模板序列的热力学稳定性,从而影响聚合酶发挥作用。GC含量过低,热力学稳定性低,导致聚合酶无法稳定扩增,或者引入高的错误率;GC含量多高导致模板稳定性过高,从而使模板解链困难,聚合酶很难发挥作用。

    Q4:16S产品有样品数量的要求,需要所有样品准备好了才能进行测序分析吗?

    A4:从科学的角度来讲,最好能够整批样品同时测序分析,既可以减少不同批次间的系统误差,还能节省项目周期。若样品准备有困难,也可以分批次启动。

    Q5:16S扩增的时候如何避免产生嵌合体?

    A5:首先应尽量保持DNA模板的完整性,避免其降解。其次,延长延伸时间,最大程度上保证延伸中的引物-模板完整延伸。另外,还可通过适度减少PCR循环次数来避免嵌合体的产生。最后,可通过分析过程去除嵌合体序列。
宏基因组测序分析
        宏基因组测序研究对象为特定环境中的全基因组DNA,通过高通量测序,获得单个样品大数据,然后进行后续数据挖掘及研究。首先能够获得特定环境中微生物物种的组成及丰度信息;其次进行物种基因组组分分析,并进行相关功能及代谢通路注释,从而获得全面的环境微生物基因组基本信息。另外根据研究目的的不同设置不同分组,进而发现不同样品间及组间差异,进而深度挖掘具有应用价值的基因资源,进一步探索环境中微生物群落内部、微生物与环境间的相互关系。
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  • 结果示例
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  • 技术参数


  • 结果示例



  • 案例1 :不同年龄段不同地理位置人肠道微生物研究
    Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 2012;486(7402):222-227

    本研究选取了531个人的粪便样本,其中115个人来自马拉维,100个来自委内瑞拉,316个来自美国。这其中有婴儿、小孩、青少年、成人、同卵双胞胎和异卵双胞胎。分别采用宏基因组测序和16s rDNA V4区测序方法对样品进行研究。
    主要得出如下结论:
    1,不同国家母乳喂养的婴儿肠道菌群功能差异较大,和美国相比另外两个国家婴儿肠道中碳水化合物代谢相关的酶和尿素酶的表达量较高,推测母亲的饮食会影响到乳汁的成分。
    2,美国与另外两个国家在饮食习惯上差异较大,相比之下美国人肠道菌群的功能以合成维生素为主,而以玉米为主食的国家人群肠道微生物以淀粉的分解利用为主。
    3,成年同卵双胞胎的肠道微生物相似度并不比异卵双胞胎的高,所以肠道菌群受遗传的因素影响较小,而且长期生活在一起的夫妻的肠道微生物相似度会高于其他人。

    不同国家不同年龄段人的肠道微生物存在明显的差异


    案例2:宏基因组研究揭秘婴儿肠道微生物在新生儿免疫形成中的重要作用
    Schwartz S, Friedberg I, Ivanov IV, et al. A metagenomic study of diet-dependent interaction between gut microbiota and host in infants reveals differences in immune response. Genome Biology. 2012;13(4):r32.

    本文采用宏基因组测序方法,主要研究三个月的6名婴儿食品喂养(BF)和6名母乳喂养(FF)婴儿肠道微生物与宿主上皮细胞转录组之间的相关关系。结果表明肠道微生物毒力相关的功能特征与不同的饮食相关,在BF和FF婴儿肠道有显著差异。尤其是抗菌机制、抵抗抗生素和毒性物质III型、IV型、ESAT分泌系统、和毒力这四个方面。肠道宏基因组和宿主转录组关联分析表明宿主的免疫和抵御基因与肠道微生物的的毒力功能特征有确定关系。

    宿主基因集与微生物毒性典型相关分析


  • 技术参数

    产品 策略 指标 周期
    宏基因组 300bp小片段文库;
    HiSeq2500 PE125测序;
    5G raw data 45个工作日

    送样要求

    样品要求 检测方法 总量 浓度
    DNA Qubit,AGE DNA≥3μg ≥50 ng/μl


  • Q1:宏基因组学可以研究哪些环境中的微生物群落?

    1,人体微生物,包括口腔,肠道,胃,呼吸道,鼻腔,生殖道,血液,皮肤等等部位的微生物群落。
    2,动物微生物,包括瘤胃,昆虫肠道等等部位的微生物。
    3,环境微生物:包括土壤,海洋,湖水,矿地,极地微生物等等。
    4,植物内生菌:植物的菌根等等。
    5,工业微生物:酿酒微生物,发酵微生物,沼气微生物等等。
    6,特殊环境的微生物:矿井、 黄石公园、 古代动物的尸骨、火山口…

    Q2:人肠道相关疾病的宏基因组研究需要对照吗?

    A2:需要,因为样品提取过程中,提取方法的差异,对物种丰度的影响较大,所以需要同时提取疾病组和对照组的样本。虽然我们有人肠道的参考基因集,但是样本大部分来自欧洲,虽然也有中国人的肠道微生物数据,这只能作为分析时的参考,不能与具体样本进行对比分析。

    Q3:宏基因组测序可以用于疾病研究吗,研究一个疾病需要多少样本数?

    A3:可以,通过肠道微生物与疾病关联分析的方法,对肥胖,肠炎以及糖尿病等疾病进行研究,一般需要疾病的样本约35例,对照组35例,每个样本的数据量约2.5G.具体的情况视疾病差异可作调整。对于疾病的研究,建议分成2步实施,首先对样本进行16SrDNA和wholegenome的survey,评估样本的的复杂程度以及宿主的污染情况。第二步根据普查研究的结果,挑选具有代表性的样本进行深度测序,降低了项目实施的风险。

    Q4:宏基因组测序样品总DNA的提取注意事项?

    A4:提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类,除需严格遵循取样规则外,取样中应尽量避免对样本的干扰,缩短保存和运输的时间,使样品尽可能代表自然状态下的微生物原貌,获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法,既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA,又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇。所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作,谨防污染,并且保持DNA 片段的完整和纯度。

    Q5:如果存在较大的宿主的污染,且没有宿主基因组的参考序列可以进行宏基因组测序吗?

    A5:如果宿主的基因组序列在环境DNA中的量比较多,测序之后,我们没有办法通过已知的宿主基因组的序列来去污染,会对最后的分析结果造成很大影响,而且可用的数据量会很少;但是如果在提取的过程,宿主基因组的污染的量很少,后期的数据分析还是可用的,但是会存在一定的风险。
宏转录组测序
        宏转录组测序是以环境中全部RNA作为研究对象,从整体水平上研究某一特定环境,特定时期环境微生物群落的全部基因组转录情况以及转录调控规律,提取环境微生物群落中的全部转录本,进行高通量测序,通过信息分析手段揭示微生物在不同环境条件下的基因调节调控和表达的差异性,与宏基因组研究相辅相成。
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  • 案例1:宏转录组和宏基因组测序揭示墨西哥湾深海溢油对环境微生物的影响
    Mason OU, Hazen TC, Borglin S, et al. Metagenome, metatranscriptome and single-cell sequencing reveal microbial response to Deepwater Horizon oil spill. The ISME Journal. 2012;6(9):1715-1727.

    本研究分别获取不同污染程度的溢油带海水(1-5L),通过宏转录组和宏基因组测序方法研究不同污染程度的溢油带微生物组成及丰度情况,主要得出如下结论:
    1. 测序结果和宏基因组比对结果表明,污染的海水微生物多样性更低,Oceanospirillales明显富集。
    2. 宏转录组测序结果分析发现Oceanosipirillales不仅是群落中丰度最高,转录活性也很高,重污染海水转录本相对丰度是46%,轻污染海水转录本相对丰度是69%。其他活性较高的有Alteromonadales,Deltaproteobacteria,Pseudomonadaales和SAR86。未组装的转录组Reads与碳氢化合物降解基因数据库对比结果发现链烷单氧酶高表达,表明在采样时段碳氢化合物降解主要途径是链烷降解。同样发现了甲烷单氧酶(Pmo)基因,但是在溢油带海水中未检测到酶活性,并且基因表达量明显低于编码链烷降解的基因,然而溢油后甲烷的浓度激增20-50倍,可能是由于甲烷氧化菌对溢油环境的滞后反应。
    主要结论如下:
    1. 大部分人肠道含有的微生物细胞是有活跃的,但也有大量被损坏的细胞。
    2. 对比host-targeted drugs,抗生素会快速影响肠道微生物细胞的生理状态。
    3. 异源性物质会刺激肠道微生物中耐药和代谢相关基因的表达。

    宏转录组中烃类物种降解相关基因分析


    案例2:宏基因组测序揭秘异源性物质对人肠道菌群和基因表达的影响
    Maurice CF, Haiser HJ, Turnbaugh PJ. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 2013;152(1-2):39-50.

    本研究选用3份健康人体的粪便,用脑心浸液肉汤培养粪便,并用不同的药物和抗生素进行干预。利用16S rDNA V4测序分析不同培养条件下物种组成的差异;通过宏转录组分析不同样品基因表达情况和对应功能的差异。

    药物作用导致微生物中基因表达变化


  • 技术参数

    产品 策略 指标 周期
    宏转录组 原核链特异性文库
    HiSeq2500 PE125测序
    3G raw data 55个工作日

    送样要求

    样品要求 检测方法 Agilgent/AGE NanoDropTM
    简单环境 Total RNA Agilent 2100
    NanoDropTM
    m≥5μg c≥150 ng/μL
    RIN≥7.0
    23S/16S≥1.0
    OD260/280≥1.8
    OD260/230≥1.8

    备注:仅适用于去除原核rRNA,构建原核链特异性文库,复杂环境请联系微生物研究部case by case沟通。


  • Q1:目前宏转录组能接受哪些环境样品?

    A1:目前只能接肠道简单环境的样品,土壤等复杂环境暂不接。

    Q2:宏转录组采用什么建库方式?

    A2:去除原核r RNA,然后采用原核链特异性文库。

    Q3:目前宏转录组产品主要难点在哪?

    A3:

    1,得到的mRNA序列不易组装。
    2,得到的新的基因,不易注释。
    3,测序比较容易,而能得到有意义的结果比较困难

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