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表观遗传测序
        表观遗传学又译为“表征遗传学”、“拟遗传学”、“表遗传学”、“外遗传学”以及“后遗传学”(epigenetics),是在研究与经典的孟德尔遗传学遗传法则不相符的许多生命现象过程中逐步发展起来的,最早由C.H.Waddinton在1942年提出。表观遗传是指在没有DNA序列变化的基础上,基因表达状态的可遗传的改变。表观遗传学是研究没有基因组DNA序列变化而基因表达及基因功能的诱导和维持却发生可遗传变化的科学。这种改变可能来自自发生成、外界因素诱发或突变触发。
        表观遗传具有三个生物特征:可遗传(修饰作用可通过有丝分裂或减数分裂在细胞或个体世代间遗传),可逆性(修饰作用可以自由发生与消除)和没有DNA序列改变。
        目前有两种主要且互通的表观修饰机制:DNA甲基化和组蛋白共价修饰。而最近几年也逐渐发现非编码RNA是一种重要的表观修饰方式。这些不同的表观修饰机制并不是完全独立的,它们有着密切的内在联系。
       表观遗传修饰对许多细胞进程、生物功能有着极为重要的作用,如基因印记、X染色体失活、细胞重构与衰老等。而如果这些表观修饰发生异常,则会导致很多有害健康的结果,如癌症或其他先天性疾病。正是由于表观修饰在癌症发育中的重要作用,对表观修饰的深入研究为检测和治疗癌症提供了可能性。表观遗传学的研究已成为基因组测序后的人类基因组重大研究方向之一。这一飞速发展的科学领域从分子水平揭示了复杂的生物学现象,为解开人类和其他生物的生命奥秘、造福人类健康带来了新希望。

WGBS(Whole Genome Bisulfite Sequencing)
        DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰,其发生机制是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)催化,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体,DNA上的胞嘧啶被选择性地添加甲基,形成5-甲基胞嘧啶。
        通常,DNA的甲基化会抑制基因表达。DNA的甲基化状态对染色体的结构维持、X染色体失活、基因印记以及胚胎发育、正常细胞功能维持,乃至疾病、癌症发生都是十分重要的。
        WGBS(全基因组重亚硫酸盐测序)自开发成功以来一直被视为甲基化测序的“金标准”。该方法的实验原理是前期用Bisulfite处理,将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U,进行PCR扩增后变成T,与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来,再结合高通量测序技术,特别适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
        WGBS产品的特点在于其单碱基甲基化的分辨率以及全基因组水平的覆盖度,是精确构建全基因组甲基化图谱的最优选择。
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  • 案例:WGBS构建昆虫物种家蚕的全基因组甲基化图谱
    Xiang, H., Zhu, J., Chen, Q., Dai, F., Li, X., Li, M., Zhang, H., et al. (2010). Single base-resolution methylome of the silkworm reveals a sparse epigenomic map. Nature Biotechnology, 28(5), 516-520.

    以昆虫生物家蚕为研究对象,使用WGBS技术得到了家蚕的全基因组甲基化图谱,确定家蚕的低甲基化特征,且甲基化发生在CpG上;发现家蚕DNA甲基化主要发生在基因本体区间和smRNA中,而在启动子、转座子上表现出明显的低甲基化;同时与转录组数据的联合证实了基因本体DNA甲基化对基因表达的促进作用。

    图1 家蚕DNA甲基化图谱

    图1显示了家蚕基因组中的甲基化C位点的CpG甲基化模式特征(a)、中等甲基化水平(b)以及甲基化位点在染色体上的对称分布(c)。

    图2 家蚕DNA甲基化与基因表达关系图

    图2放映了DNA甲基化与基因表达在基因本体区间的正相关特征,表明家蚕中的DNA甲基化对基因表达有促进作用。


  • 技术参数

    测序平台 测序策略 数据量 周期
    HiSeq
    MiSeq
    91PE
    101PE
    大基因组物种:30X基因组
    小基因组物种: 2G
    45个工作日

    送样要求

    样品类型 检测方法 数据量:样品总量 浓度 其他要求
    DNA Agilent 2100 ≤25G: ≥5 µg
    26~50G: ≥10 µg
    51~75G: ≥15 µg
    76~100G: ≥20 µg
    ≥30ng/ul OD260/280= 1.8~2.0
    A260/A230≥1.6


  • 1. WGBS有哪些特点?

    a) 精确的单碱基分辨率,可以得到每一个C位点甲基化信息;

    b) 全基因组覆盖,可以得到完整的基因组甲基化图谱;

    c) 大数据量需求,需要大量数据(约30倍基因组大小)来达到基因组覆盖要求。

    2. WGBS需要多少数据量?

    WGBS是全基因组覆盖度的分析技术,因此所需数据大约是参考基因组大小的30倍,即人推荐100G数据量,拟南芥推荐5G数据量,对于某些小物种则建议2G数据量。 越大数据量,会带来越深的基因组覆盖,会有更好的数据结果。

    3. WGBS有哪些物种无法处理?

    WGBS技术目前十分成熟,基本可以适用于任何有参考基因组的物种。

    4. WGBS技术如何确定C位点甲基化水平?

    在覆盖到某一C位点的序列中,统计C碱基出现的次数即为该位点甲基化水平。 因为非甲基化C位点都会在bisulfite实验中转化为T,而还出现的C就是甲基化C位点,可以据此得到位点甲基化水平。

    5. WGBS项目在开始前需要考虑哪些因素?

    a) 物种参考基因组是否有完整版本

    b) 物种甲基化特征,是否为明显极低甲基化

    c) 基因组是否存在复杂结构,如GC含量偏高、重复序列偏多等

RRBS(Reduced Representation Bisulfite Sequencing)
        提到基于二代测序平台的全基因组甲基化研究,首先想到的必然是“金标准”WGBS,即全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing)。但是该方法需要大量数据达到全基因组覆盖,所需费用也相对较高。为了能用较低的成本得到甲基化信息,有两种性价比非常高的测序方法不得不提,那就是MeDIP-seq(甲基化DNA免疫共沉淀测序)和RRBS(简化的表观亚硫酸氢盐测序技术,Reduced Representation Bisulfite Sequencing)。
       2005年Alexander Meissner等在Nucleic Acids Research首次提出该方法[1],之后被许多研究人员采用[2]。该方法前期用MspI酶切,该酶的酶切位点为CCGG,从而将CpG位点富集出来,之后再进行bisulfite处理实现C与mC的单碱基区分,最终用较小的数据量得到包含最多CpG位点甲基化信息的单碱基精度的甲基化图谱。
        RRBS由于经过了Bisulfite 处理,凭借着其单碱基分辨率,能够精确评估覆盖区域的甲基化水平。再加上酶切打断的原理,该方法的覆盖范围具有良好的重复性和稳定性;并且能通过酶切位点过滤部分降解片段对结果的影响。但是RRBS 的覆盖范围被酶切位点所限制,只能覆盖基因组的部分区域,主要集中在promoter 和CpG island 等富含CpG 的区域。在疾病研究中,Promoter 的甲基化状态与基因表达、性状表型息息相关,RRBS 作为一种关注CpG-rich 区域的甲基化研究方法,能够避免过多的数据浪费,更有针对性的研究覆盖区域的甲基化状态,使得大样本量单碱基分辨率的甲基化差异研究成为可能。
        综上所述:RRBS 作为一种高性价比的甲基化研究方法,在大规模的临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
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  • 案例:RRBS技术构建绵羊甲基化图谱,解读绵羊基因组中DNA甲基化对基因表达调控机制
    Couldrey C, Brauning R, Bracegirdle J, Maclean P, Henderson HV, et al. (2014) Genome-Wide DNA Methylation Patterns and Transcription Analysis in Sheep Muscle. PLoS ONE 9(7): e101853. doi:10.1371/journal.pone.0101853

    使用RRBS技术对绵羊进行DNA甲基化分析,构建了绵羊的高甲基化特征;同时结合转录组数据阐述了TSS上DNA甲基化对基因表达的抑制作用。

    图 DNA甲基化水平分布

    图1显示了DNA甲基化在基因区(A)和基因间区(B)的甲基化水平分布,60~90%区间的高比例反映了绵羊的高甲基化特征。

    图2 DNA甲基化与基因表达关系图

    图2显示了在高CpG密度基因(A)中DNA甲基化有TSS低甲基化特征,且DNA甲基化有对基因表达的抑制作用;而在低CpG密度基因(B)中DNA甲基化基本平稳,但也表现出了对基因表达的抑制。


  • 技术参数

    测序平台 测序策略 数据量 周期
    HiSeq / MiSeq 50PE / 91PE 5G 30个工作日

    送样要求

    样品类型 检测方法 样品总量 浓度 其他要求
    DNA Agilent 2100 ≥6µg ≥30ng/ul OD260/280= 1.8~2.0


  • 1. RRBS有哪些特点?

    RRBS是使用MspI酶进行基因组酶切处理,选取其中40-220bp片段构成分析数据。因此RRBS的特点主要有:

    d) 单碱基分辨率;

    e) 特定区间覆盖,主要在CGI、Promoter区间;

    f) 小数据量,RRBS只需要5G数据量即可完成对酶切区间的覆盖。

    2. RRBS适用于哪些物种?

    目前的RRBS技术只能适用于人、小鼠,其他物种的RRBS技术可以尝试但无法给出任何技术保证。

    3. RRBS项目在开始前需要考虑哪些因素?

    RRBS技术目前只适用于人和小鼠,因此没有参考基因组等方面的担心。 但是RRBS需要考虑一个至关重要的问题:分析目标是否会被RRBS的酶切区间覆盖?

    4. RRBS在具体位点甲基化分析上与WGBS是否有差异?

    没有差异。

    RRBS与WGBS都是用bisulfite处理来得到单碱基分辨率,分析思路也都是一致的,因此两者在具体位点甲基化分析上是完全一致的。

    5. RRBS适用于哪些类型项目?

    RRBS使用于已知目标区间、大样品量的甲基化数据分析。

MeDIP-Seq (Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing)
        提到基于二代测序平台的全基因组甲基化研究,首先想到的必然是“金标准”WGBS,即全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing)。但是该方法需要大量数据以达到全基因组覆盖,所需费用也相对较高。为了能用较低的成本得到甲基化信息,有两种性价比非常高的测序方法不得不提,那就是MeDIP-seq(甲基化DNA免疫共沉淀测序)和RRBS(简化的表观亚硫酸氢盐测序技术,Reduced Representation Bisulfite Sequencing)。
       MeDIP最先由Weber M.et al提出,基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术,采用甲基化DNA免疫共沉淀技术,通过5'-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段,然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。该方法优点在于精度高,覆盖广,性价比高,但是不足之处是无法得到单碱基分辨率,只能知道一段区域的甲基化程度。
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  • 案例:MeDIP-Seq技术帮助解读鸟类物种鸡的甲基化特征
    Li Q, Li N, Hu X, Li J, Du Z, et al. (2011) Genome-Wide Mapping of DNA Methylation in Chicken. PLoS ONE 6(5): e19428. doi:10.1371/ journal.pone.0019428

    文章以鸡为鸟类模式生物,以MeDIP-Seq技术分析DNA甲基化数据,构建了鸡的甲基化图谱,明确了鸡DNA甲基化模式与其他动植物相似:甲基化主要集中在基因本体和重复区间,而在TSS和TTS中表现出低甲基化特征,鸡基因组中的大部分CGI都是非甲基化状态;且与表达数据联合分析显示了启动子区间的DNA甲基化与基因表达呈现负相关特性,表明启动子DNA甲基化为基因表达的抑制作用。

    图1 基因范围甲基化水平分布

    图1显示了基因及上下游中DNA甲基化的变化特征,表明鸡在基因本体中高甲基化、TSS及TTS的低甲基化特征。


  • 技术参数

    测序平台 测序策略 数据量 周期
    HiSeq / MiSeq 50PE / 91PE 5G 30个工作日

    送样要求

    样品类型 检测方法 样品总量 浓度 其他要求
    DNA Agilent 2100 ≥6µg ≥30ng/ul OD260/280= 1.8~2.0


  • 1. MeDIP-Seq技术能否达到全基因组覆盖?

    理论上MeDIP-Seq是针对基因组中甲基化区间进行富集处理的方法,因此可以实现对全基因组中的覆盖。

    2. MeDIP-Seq能否得到精确甲基化信息?

    不能。

    MeDIP-Seq是对含甲基化位点的序列进行捕获来构建序列文库的,因此无法得到位点精确甲基化信息,其甲基化水平会表现的较正常水平偏高。

    3. MeDIP-Seq的结果如何验证?

    可以通过多种单碱基分辨率的甲基化分析方式进行验证,如RRBS、TBS、TA-clone等。

    4. MeDIP-Seq技术的特点是什么?

    a) 全基因组甲基化区域覆盖。

    b) 只能定性得到甲基化结果,无法得到精确甲基化数值;

    c) 小数据量要求,一般只要5G数据量即可。

    5. MeDIP-Seq适用于哪些项目?

    MeDIP-Seq适用于大样品量间的甲基化差异分析项目。

ChIP-Seq (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing)
        基因表达是一个受多因素调控的复杂过程.组蛋白是染色体基本结构-核小体中的重要组成部分,其N-末端氨基酸残基可发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚ADP糖基化等多种共价修饰作用。组蛋白的修饰可通过影响组蛋白与DNA双链的亲和性从而改变染色质的疏松或凝集状态,或通过影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性来发挥基因调控作用。组蛋白修饰对基因表达的调控有类似DNA遗传密码的调控作用。
       染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。
       ChIP-Seq的原理:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
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  • 案例:ChIP-Seq技术构建玉米基因组蛋白修饰图谱
    Xiangfeng Wang, Axel A.Elling, Xueyong Li, et al. Genome-wide and organ-specific landscapes of epigenetic modifications and their relationships to mRNA and small RNA transcriptomes in maize. Plant Cell. 2009, 21(4):1053-69.

    研究者使用ChIP-Seq技术对玉米芽和根分别进行组蛋白修饰分析,得到玉米组带白修饰图谱,发现玉米基因本体的组蛋白修饰富集明显,但转座子上组蛋白修饰很少。同时结合mRNA数据和smRNA数据发现玉米基因组中H3K27me3和DNA甲基化对基因表达有抑制作用,而其他组蛋白修饰(H3K4me3、H3K9ac、H3K36me3)对基因表达存在正相关特性。

    图1 玉米表观修饰、基因表达可视化视图

    图1显示了在某一基因上各种表观修饰和基因表达特征。可以发现基因5`端的H3K9ac、H3K36me3、H3K4me3修饰很明显,这些类型的富集修饰促进了基因表达。

    图2 组蛋白修饰与基因表达的关系

    图2显示了H3K4me3在基因本体上的高度富集,尤其是ATG区间。结合表达数据可以发现,ATG和基因本体的H3K4me3作用对基因表达呈正相关特征。


  • 技术参数

    测序平台 测序策略 数据量 周期
    HiSeq / MiSeq 50SE 20M / 40M序列 30个工作日

    送样要求

    样品类型 检测方法 样品总量 浓度 其他要求
    DNA Agilent 2100 ≥20ng ≥1ng/ul OD260/280=1.8~2.0
    Chip后的q-PCR验证结果


  • 1. ChIP-Seq适用于哪些分析项目?

    ChIP-Seq适用于组蛋白修饰及转录因子修饰分析的项目。

    2. ChIP-Seq项目在开始前需要考虑哪些因素?

    a) 是否有完整物种参考基因组;

    b) 是否有合适的抗体用于富集反应;

    c) 如何设置实验对照组。

    3. ChIP-Seq实验是否需要设置实验对照?

    a) 对照设置是必须的;

    b) Input对照可以用于检测测序序列是否均匀分布;

    c) IgG抗体对照用于检测抗体富集特性,去处非特异性富集噪音。

    4. ChIP-Seq结果影响因素主要有哪些?

    a) 样品污染,会导致有效数据量低,无法完成分析;

    b) 测序质量低,会导致数据质量和分析结果不可靠;

    c) 抗体富集效果不好,会导致无法顺利找到修饰结果;

    d) 对照设计不好,会导致修饰结果可靠性较低。

    5. ChIP-Seq是否能分析任何蛋白修饰类型?

    不行。

    目前ChIP-Seq只能分析已有富集抗体的蛋白修饰类型。


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